拉里·达利（本·斯蒂勒饰）的博物生活似乎一直陷入困境：频繁更换工作、居无定所；妻子与他离婚，馆奇并且很快就与一位证券经纪人再婚。妙夜在这种情况下，博物为了挽救自己的馆奇生活以及争取到儿子的抚养权，他不得不放弃追求“大事业”的妙夜梦想，成为纽约自然博物馆的博物夜间警卫。达利原本以为这份工作毫无意义，馆奇但上班的妙夜第一天就发生了意想不到的事情：当夜晚降临，博物馆内的博物标本们竟然活了过来。霸王龙追逐着骨骼、馆奇猴子肆无忌惮地捣乱、妙夜匈奴王显得暴虐不羁……这些情景让博物馆变成了一片混乱的博物海洋。幸运的馆奇是，在第26任总统特迪·罗斯福的妙夜帮助下，达利成功控制了局面。然而，新的危机接踵而至：有人试图盗取法老金牌的秘密。出于职责所在和对这份神奇奇迹的保护，达利不得不站出来对抗这股不速之客，展开了一场紧张刺激的冒险。
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